石蠟切片tunel實(shí)驗(yàn)染凋亡細(xì)胞-上海鄭核
一、實(shí)驗(yàn)器材及試劑
1、實(shí)驗(yàn)器材
名稱 廠家 型號(hào)
脫水機(jī) 武漢俊杰電子有限公司 JJ-12J
包埋機(jī) 武漢俊杰電子有限公司 JB-P5
病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司 RM2016
凍臺(tái) 武漢俊杰電子有限公司 JB-L5
組織攤片機(jī) 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司 KD-P
烤箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)儀器有限公司 DGX-9003B
載玻片 Servicebio
掌上離心機(jī) Servicebio D1008E
脫色搖床 Servicebio TSY-B
渦旋混合器 Servicebio MX-F
移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573
顯微鏡 CIC XSP-C204
組化筆 Gene tech GT1001
2、主要實(shí)驗(yàn)試劑
試劑 廠家 貨號(hào)
二甲苯 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
無(wú)水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
PBS緩沖液 Servicebio G0002
蛋白酶K Servicebio G1205
破膜液 Servicebio G1204
3%雙氧水 Servicebio G0115
蘇木素染液 Servicebio G1004
蘇木素分化液 Servicebio G1039
蘇木素反藍(lán)液 Servicebio G1040
中性樹(shù)膠 Servicebio G1403
Tunel試劑盒 Roche 11684817910
DAB顯色劑 Servicebio G2111
二、石蠟切片tunel實(shí)驗(yàn)步驟
1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無(wú)水乙醇Ⅰ10min-無(wú)水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。
2、修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫(huà)圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37度溫箱孵育25min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
4、加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按1:9混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃水浴鍋孵育2小時(shí)，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
5、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
6、加試劑3：切片稍甩干后，每張切片加適量試劑3(converter-POD）覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
7、DAB顯色：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為細(xì)胞核呈棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。
8、復(fù)染細(xì)胞核：蘇木素復(fù)染3min左右，自來(lái)水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。
9、脫水封片：將切片依次放入70%酒精5min-80%酒精5min -90%酒精5min -95%酒精5min -無(wú)水乙醇Ⅰ5min -無(wú)水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片。
三．結(jié)果判斷
蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出來(lái)的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核為棕黃色
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